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微生物學筆記
| 一、形態大小... 一、形態大小 單細胞，無鞭毛。細胞形態多樣，常見球、卵、圓桶形。 大小在1-5um X 5-30um之間。 二、細胞結構 1、細胞壁：厚0.1-0.3um，三層，由酵母纖維素組成（甘露聚糖、葡聚糖、蛋白、類脂）。用蝸牛酶（heliase）破壞壁來制備原生質體。 2、細胞膜：與原核基本相同，但含甾醇（麥角固醇）。由于有細胞器分化，功能不及細菌多，主要是調節滲透壓、吸收營養、分泌代謝物等 3、細胞質及內含物 4、細胞核：真核：雙層單位膜，大量核孔，可見染色體，一個或幾個核仁，核膜外有中心體。 5、線粒體：含有一環狀DNA。呼吸酶系載體， 動力工廠 。有氧時需要，厭氧或過量葡萄糖存在時，被阻遏。 環狀 2um質粒 ：外源DNA載體。 6、核糖體：細胞質中80S，線粒體70S。 三、菌落特征 與細菌相似，但大且厚。 四、繁殖方式與生活史 （一）繁殖方式 1、無性繁殖 (1)芽殖 budding：最普遍方式（過程） (2)裂殖 fission：少數（裂殖酵母） (3)無性孢子：節孢子、擲孢子、厚垣孢子。 2、有性繁殖 產生子囊和子囊孢子。過程：質配--核配--減數分裂 3、形成孢子條件 營養充足強壯幼齡細胞 適當溫、濕度（25-30，80%） 空氣要流通 適當的生孢子培養基 （二）生活史 life history(life cycle) 某種生物在整個發育階段，有一個或幾個同形或不同形的個體前后相繼形成一個有規律的循環。 四種基本類型： 1、無生殖，僅有營養繁殖。（細菌） 2、僅有一個單倍體生活，雙倍體短。 3、僅有一個雙倍體生活，單倍體短。 4、有世代交替現象，單倍體有性，雙倍體無性。 酵母菌有三種類型： 單倍體型：八孢裂殖酵母 雙倍體型：路德類酵母 世代交替型：釀酒酵母 五、常見常用酵母菌 酵母圖示 5節：霉菌 molds 非分類名詞，絲狀真菌統稱。通常指菌絲體發達而又不產生大型子實體的真菌。 一、形態和構造 營養體由菌絲（hyphae)構成，直徑3-10um，菌絲再形成菌絲體（mycelium） 菌絲：無隔，多核單細胞，低等真菌 有隔，多細胞，高等真菌 菌絲體：營養菌絲，伸入培養基吸收營養 氣生菌絲，向空中生成，形成繁殖器官。（特化形式） 細胞壁厚100-250nm，多含幾丁質。 不同類型真菌壁成分比較 二、繁殖與生活史 （一）繁殖 1、無性孢子：主要方式，特點是分散，數量大。 孢囊孢子：內生孢子，毛、根、犁頭霉 分生孢子：外生孢子，最普遍 節孢子：粉孢子，菌絲斷裂形成 厚垣孢子：真菌休眠體 2、有性孢子 卵孢子：配子囊（雄器、藏卵器） 接合孢子：同宗、異宗配合 子囊孢子：形態多樣。子實體、子囊果 擔孢子：擔子菌特征 （二）生活史 霉菌指從一種孢子開始，經過一定的生長和發育，最后又形成同一種孢子為止。 三、菌落 疏松，絨毛狀、絮狀、蛛網狀。 四大類微生物比較： 四、分類 過去依據菌絲體及有性繁殖特征分為三綱一類，藻狀菌綱、子囊菌綱、擔子菌綱、半知菌類。 Ainsworth 分類系統： 五、常見常用霉菌 中國食用和藥用大型真菌 (一)食用真菌 1、種類資源：擔子菌675種，子囊菌45種。通常栽培的僅10多種。 2、營養：蛋白含量高，AA多達18種左右，特別是人體必需AA。還含有多種維生素、糖類和礦物質。Lys含量一般較高。 3、栽培：發展栽培同時，重視采用菌絲體的深層培養，特別是風味特殊而鮮美的種類。菌絲體培養物可新鮮食用，或冷凍干燥成粉，制成食品。 目前栽培廣而產而產量大的品種：雙孢菇、大肥菇、香菇、草菇、金針菇、側耳（平菇）、鳳尾側耳、滑菇、銀耳、木耳、猴頭菌、長裙竹蓀等。 培養料來源多且廣，棉子殼、鋸末、秸桿、蔗渣、酒糟等。 4、應用：食用子實體、菌絲體深層培養。作調味品、香味、飲料等。 （二）藥用真菌 1、資源：擔子菌345種，子囊菌28種，其它11種。 2、應用：有20多個方面，主要抗癌、抑菌。目前認為抗癌物質主要是多糖，如香菇多糖、銀耳酸性異多糖、蕓芝多糖（PSK）、茯苓多糖、豬苓多糖、靈芝多糖等。 細胞型生物小結 真菌、細菌、放線菌比較： 真核、原核區別： 6節：病毒 virus 非細胞型生物，有區別于細胞型特征： 1、形體十分微小，濾過，電鏡可見； 2、無細胞結構，分子生物，由核酸和蛋白組成，且一種病毒僅含一種類型核酸； 3、專性活細胞內寄生，有宿主專一性，無獨立代謝酶系，依賴宿主自身復制； 4、對抗生素不敏感，對干擾素敏感。 概念：病毒是超顯微的，無細胞結構，專性活細胞內寄生，在活細胞外具一般化學大分子特征，一旦進入宿主細胞又具有生命特征。 根據宿主不同，可把病毒分為幾類，如動物病毒、植物病毒、昆蟲病毒、細菌病毒等。 病毒的核酸與細胞型也不同。 一、形態、結構和化學組成 1、大小：nm, 多在100nm左右。圖片 2、病毒粒子 virion (病毒顆粒） 成分：核酸--核心core 核衣殼 蛋白--衣殼capsid nucleocapsid 衣殼粒 capsomere 包膜（類脂或脂蛋白）envelope 病毒粒子對稱體制：螺旋對稱（TMV） 廿面體對稱（腺病毒） 功能：核酸：遺傳物質基礎 蛋白：構成外殼，保護病毒免受核酸酶及其它因子破壞；決定感染特異性；決定抗原性。 3、噬菌體 phage：多為蝌蚪狀，結構模式圖。頭部為廿面體對稱，尾部為螺旋對稱。 4、群體形態：病毒包涵體、噬菌斑 二、繁殖（烈性噬菌體為例） 1、吸附：分兩階段。感染復數m.o.i 2、侵入：頭部DNA通過尾管注入至細胞中，外殼留在胞外。自外裂解 3、增殖：包括DNA復制和蛋白質合成。雙鏈DNA噬菌體三階段轉錄： 遺傳信息轉移： 4、成熟（裝配）：潛伏期 5、裂解（釋放）：裂解期 上述烈性噬菌體的生長方式，稱為一步生長。 一步生長曲線： 裂解量：每個被感染的細菌釋放新的噬菌體的平均數。 三、噬菌體與宿主關系 1、烈性噬菌體：凡能引起宿主細胞迅速裂解的噬菌體。敏感細菌。 2、溫和性噬菌體：噬菌體侵染宿主后，并不增殖，裂解，而與宿主DNA結合，隨宿主DNA復制而復制，此時細胞中找不到形態上可見的噬菌體，這種噬菌體稱為溫和性噬菌體。含有溫和性噬菌體的細菌稱為溶源性細菌lysogenic bacteria 溫和性噬菌體存在狀態 1）游離具感染性的virion； 2）前噬菌體（prophage）：附著或整合在宿主染色體上，一道復制； 3）營養期噬菌體：指導合成。 3、溶源性細菌特性 1）遺傳性 2）自發裂解 3）誘發裂解：雙氧水、UV、X、等。 4）免疫性 5）復愈（消失溶源性） 6）溶源轉變 溶源性菌株命名 四、噬菌體分離檢查與防治 （一）分離檢查（效價測定） 怎樣證實有噬菌體存在：宿主特異性；噬菌斑、液體培養變清等。 1、雙層平板法 2、單層平板法 3、玻片快速法 效價（titre），噬菌斑形成單位（pfu） （二）防治措施 1、消滅phage，杜絕其依賴生存條件。 2、選育和使用抗phage菌株。 3、菌種輪換使用。 4、藥物防治：加入某些金屬螯合劑、表面活性劑。 五、亞病毒 1、類病毒viroid：沒有衣殼包裹的RNA分子。 2、擬病毒virusoids(類類病毒）：一類包括在植物病毒粒子中的類病毒，RNA。 3、朊病毒prion, virino：一類能侵染動物并在宿主細胞內復制的小分子無免疫性的疏水性蛋白。 艾滋病 AIDS 獲得性免疫缺陷綜合征 1981年首先在USA發現，1983年巴斯德研究所宣布分離出一種virus證實為AIDS的病原，1986年WHO定名為人類免疫缺陷病毒（HIV）。 HIV專門侵犯淋巴細胞，造成免疫缺陷。 傳播途徑：血液、母嬰、體液 第二章：微生物營養和培養基 了解不同微生物需要什么營養物，怎樣吸收，起什么作用，如何為其配餐。 營養物：必須得到的細胞結構 成分，必須得到的能量儲存物質。 營養：把營養物從外界吸收至細胞內，復制出新細胞結構的過程。 1節：營養物及其功能 一、細胞化學組成 整個生物界大體相同，主要是C、H、O、N（占干重90-97%），C（約50%），此外為各種無機元素，由這些元素再組成化合物。其中C/N一般是5:1。 1、水分和無機元素 含水70-90%（鮮重），無機元素（3-10%干重）依次為P、S、K、Mg、 Ca、Fe、Zn、Mn等。 2、有機物 蛋白質,核酸,碳水化合物,類脂,維生素等 二、主要營養物及其功能 主要功能：提供合成原生質和代謝產物原料；產生合成反應及生命活動所需能量；調節新陳代謝。 （一）碳源物質 定義：凡能提供微生物營養所需碳元素的營養源。 功能：碳源、能源 微生物碳源譜： （二）氮源物質 定義：凡能提供微生物營養所需氮元素的營養源。 功能：氮源，一般不作能源。 微生物氮源譜： 氨基酸自養型和異養型生物 速效氮源和遲效氮源 生理堿性、酸性、中性鹽 （三）能源 化學能：有機物-化能異養微生物 無機物 -化能自養微生物 光能 （四）生長因子 定義：一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳、氮源自行合成的所需極微量的有機物。 種類：維生素、AA、base、FA等。 作用：輔酶或酶活化 來源：酵母膏、玉米漿、麥芽汁等，復合維生素。 濃度： （五）無機鹽 所需濃度在10-3-10-4M的元素為大量元素 所需濃度在10-6-10-8M為微量元素。 主要功能：構成菌體成分；酶活性基組成或維持酶活性；調節滲透壓、pH、Eh；化能自養微生物能源等。 無機元素來源與功能： 一些無機元素加入鹽： （六）水 存在狀態：游離態（溶媒）和結合態（結構組成） 生理作用：組成成分；反應介質；物質運輸媒體；熱的良導體。 2節：微生物營養類型 依碳源不同： 異養型heterotrophs（不能以CO2為主要或唯一碳源。 自養型autotrophs（能以CO2為主要或唯一碳源。 依能源不同： 光能營養型phototrophs（光反應產能） 化能營養型chemotrophs （物質氧化產能） 這樣可將微生物分成四種營養類型 （插入） 其中，化能異養型又據利用有機物特性，分成腐生和寄生。 營養類型劃分不是絕對的，不同生活條件下，可相互轉變。 3節：營養物吸收與代謝物分泌 營養物吸收至胞內被利用，代謝物分泌到胞外以免積累，這就是物質運輸過程。 通透性與吸收是不同概念。 一般 大分子：先水解為小分子，再吸收。 脂溶性物質：易透過 離子化合物：弱快強慢（極性） 一、營養物吸收 1、單純擴散 simple diffusion 依靠胞內外溶液濃度差，順濃度梯度運輸，不消耗代謝能，無特異性。水、二氧化碳、氧氣、甘油、乙醇等。 2、促進擴散 facilitated diffusion 借助載體蛋白順濃度梯度運輸，不耗能，有特異性。載體蛋白（滲透酶）有底物特異性，是誘導產生的。硫酸根、磷酸根、糖（真核） 3、主動運輸 active transport 吸收營養物的主要機制。 逆濃度梯度運輸，耗能，需載體蛋白，有特異性。氨基酸、乳糖等糖類、鈉、鈣等無機離子。 親和力改變←蛋白構象改變→耗能 上述3種方式中，被運輸的溶質分子都不發生改變。 4、基團轉位 group translocation 屬主動運輸，但溶質分子發生化學修飾-定向磷酸化。主要依賴磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸轉移酶系統（PTS）。 PEP+ HPr<=>丙酮酸+P-HPr (EI) 糖+P-HPr<=>糖-P+HPr (EII) 膜對大多數磷酸化合物具有高度的不滲透性。葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等。 二、代謝物分泌 微生物能分泌多種物質，如有機酸、糖類、胞外酶、莢膜多糖等，由此可知，分泌與吸收不是同一機制。 4節：培養基 medium 選用各種營養物質，經人工配制用來培養微生物的基質。 一、培養基類型 1、依來源不同：合成、天然、半合成。 2、依狀態不同：固體、半固體、液體。 3、依功能不同：選擇、鑒別 二、選擇和配制培養基的原則和方法 （一）四個原則 1、目的明確 培養什么微生物，獲得什么產物，用途 2、營養協調 恰當配比，尤其是C/N比（100/0.5-2） 3、物理化學條件適宜 pH，考慮區別，培養基調節能力。采用磷酸緩沖液或假如碳酸鈣，流加酸堿。 滲透壓和水活度 aw : 等滲適宜。 aw表示在天然環境中，微生物可實際利用的自由水或游離水含量。微生物適宜生長的aw為0.6-0.998之間。氧化還原電位Eh：好氧微生物+0.1v以上；兼性厭氧+0.1v以上行好氧呼吸， +0.1v以下行發酵；厭氧微生物+0.1v以下生長。 4、經濟節約 以粗代精、以廢代好、以簡代繁等。 （二）四種方法 1、生態模擬 2、查閱文獻 3、精心設計 4、實驗比較 第三章：微生物代謝 廣義的代謝--生命體進行的一切化學反應。 代謝分為能量代謝和物質代謝，分解代謝和合成代謝。 分解代謝：復雜營養物分解為簡單化合物（異化作用）。 合成代謝：簡單小分子合成為復雜大分子（同化作用） 二者關系 初級和次級代謝 依據代謝產物在微生物中作用不同，又有初級代謝和次級代謝。 初級代謝：能使營養物轉化為結構物質、具生理活性物質或提供生長能量的一類代謝。產物有小分子前體物、單體、多聚體等生命必需物質。 次級代謝：某些微生物中并在一定生長時期出現的一類代謝。產物有抗生素、酶抑制劑、毒素、甾體化合物等，與生命活動無關，不參與細胞結構，也不是酶活性必需，但對人類有用。 二者關系：先初后次，初級形成期也是生長期，只有大量生長，才能積累產物。 1節：微生物能量代謝 微生物對能量利用： 有機物 化能異養菌 日光 光能營養菌 通用能源 還原態無機物 化能自養菌 ATP 只有ATP和酰基輔酶A起偶聯作用，其他高能化合物只作為?P供體。 生物氧化過程分為：脫氫、遞氫、受氫三個階段。 生物氧化功能：產能（ATP）、產還原力[H]、產小分子中間代謝物。 以下主要講述化能異養微生物的生物氧化和產能。 一、底物（基質）脫氫的四條主要途徑 以葡萄糖作為典型底物 1、EMP途徑（糖酵解途徑） 有氧時，與TCA連接，將丙酮酸徹底氧化成二氧化碳和水。 無氧時，丙酮酸進一步代謝成有關產物。 2、HMP途徑（己糖-磷酸途徑） 產生大量NADPH2和多種重要中間代謝物。 3、ED途徑 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途徑 KDPG 是少數缺乏完整EMP的微生物具有的一種替代途徑，細菌酒精發酵經ED進行。 4、TCA循環（三羧酸循環） 真核在線粒體中，原核在細胞質中。 TCA在代謝中占有重要樞紐地位 四種途徑產能比較： 二、遞氫和受氫 根據遞氫特別是最終氫受體不同劃分 1、發酵（分子內呼吸） 無氧條件下，底物脫氫后產生的還原力不經呼吸鏈而直接傳遞給某一中間代謝物的低效產能反應。 在此過程中，有機物是氧化基質，又是最終氫受體，且是未徹底氧化產物，結果仍積累有機物，產能少。 在發酵過程中，借底物水平磷酸化合成ATP，是合成ATP唯一方式。 X?P + ADP ? ATP + X 高能化合物：1 ，3- 二磷酸甘油酸、乙酰磷酸、氨甲酰磷酸、PEP、 酰基輔酶A。 2、有氧呼吸（呼吸作用） 底物脫氫后，經完整的呼吸鏈（電子傳遞鏈）遞氫，以分子氧作為最終氫受體，產生水和放出能量。 在電子傳遞過程中，通過與氧化磷酸化反應偶聯，產生ATP，稱氧化磷酸化。 1）呼吸鏈組成與順序： 2）真核與原核生物呼吸鏈比較： 位置、組成 3、無氧呼吸（厭氧呼吸） 以無機氧化物代替分子氧作為最終氫受體的生物氧化。 氧化磷酸化合成ATP，但有些能量轉移到最終受體，產能不多。 依據最終氫受體不同，分成多種類型。 1）硝酸鹽還原作用（反硝化作用） 由硝酸鹽逐步還原成分子氮的過程。使土壤N損失，肥力下降。屬異化性硝酸鹽還原。 2）硫酸鹽還原作用（異化性） 通常以乳酸為基質，積累乙酸，以SO42-為最終氫受體。脫硫弧菌 Desulfovibrio sp. 3)甲烷發酵作用 產甲烷菌以二氧化碳為最終氫受體。如甲烷桿菌 Methanobacterium 四、不同呼吸類型微生物 與分子氧的不同關系 1、好氧微生物 aerobic 有氧條件下生長，進行有氧呼吸。 2、厭氧微生物 anaerobic 不需分子氧，進行無氧呼吸或發酵。 專性厭氧菌-只能在無氧條件下生長，分子氧對其有害。主要梭菌、產甲烷細菌、脫硫3、兼性厭氧微生物 facultative anaerobic 有氧與無氧條件下均能生長，但以不同氧化方式獲得能量。 如酵母菌、一些腸道菌、反硝化細菌。 酵母菌酒精發酵時通入氧氣，發酵減慢，停止產生乙醇，葡萄糖消耗速率下降，氧對發酵的這種抑制現象稱為巴斯德效應。 4、微好氧微生物 microaerophilic 在氧濃度較低條件下生長，進行有氧呼吸。 氧的危害 O2 + e → O2- 超氧化物自由基 有一些酶可解除危害。 五、不同發酵類型 對G發酵產物不同劃分，糖的無氧降解。 （一）乙醇發酵： EMP 脫羧酶 脫氫酶 1.酵母無氧條件 ：G → 丙酮酸 → 乙醛 → 乙醇 此屬正常形式，稱Ⅰ型發酵，亦稱同型酒精發酵 2.若有亞硫酸酸氫鈉存在，與乙醛結合，而使磷酸二羥丙酮作為受氫體。 磷酸二羥丙酮 → α-磷酸甘油 → 甘油 此稱為Ⅱ型發酵，但仍有乙醇產生。 3．堿性條件下（PH7.6），乙醛分子間歧化反應 一分子乙醛 → 乙酸（氧化） 一分子乙醛 → 乙醇（還原） 還有磷酸二羥丙酮 → 甘油 4．細菌同型酒精發酵，ED途徑進行，產生2分子乙醇。 5．細菌異型酒精發酵，通過HMP途徑進行，產生1分子乙醇和1分子乳酸。 總反應式如下： G+2ADP+2Pi → 2乙醇+2 CO2+2ATP G+HSO3- → 甘油+乙醛oHSO3-+CO2 2G → 2甘油+乙酸+乙醇+CO2 G+ADP+Pi → 2乙醇+2 CO2+ATP G+ADP+Pi → 乳酸+乙醇+CO2+ATP （二）乳酸發酵 發酵產物中只有乳酸，經 EMP途徑，稱為同型乳酸發酵（德氏乳桿菌）。 發酵產物中除乳酸外，還有其他，如乙醇、CO2等稱異型乳酸發酵。經HMP 途徑。如腸膜狀明串珠菌Leuconostoc mesenteroides 總反應式： 同型：G+2ADP+2Pi → 2乳酸+2ATP 異型：G+ADP+Pi → 1乳酸+乙醇+CO2+ATP 真菌：丙酮酸→ 2分子乙醇→琥珀酸→延胡索酸 →蘋果酸 → 乳酸 三）丁酸型發酵 Clostridium 所進行，特點是產物中都有丁酸。不同種類因酶系統不同，最終產物除丁酸外，還有其他產物。重要的有丁酸發酵、丙酮丁醇發酵、丁醇異丙醇發酵。 （四）丙酸發酵 由丙酸細菌Propionibacterium，與乳酸細菌相似，發酵產物有丙酸、乙酸、CO2。 丙酸 → 丙酸鈣（防腐劑） （五）混合酸發酵 腸桿菌特征，產物有甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等有機酸，還有CO2、H2、少量2，3-丁二醇、乙酰甲基甲醇、甘油等。其中兩個重要的鑒定反應： 1．V．P．實驗（Vagex-Proskauer） 產氣氣桿菌產2，3-丁二醇比較多，堿性條件下可氧化為二乙酰，再與肌酸或胍類衍生物縮合成紅色物質，若加入α-萘酚、肌酸可促進反應，此稱VP反應。 大腸桿菌不產生或少產生2，3-丁二醇，VP反應陰性。 2．甲基紅（M.R）反應 大腸桿菌產酸多，使pH降至4.2, 甲基紅由黃變紅，反應陽性。產氣氣桿菌產2，3-丁二醇，產酸少（pH5.3），甲基紅反應陰性。 3．另外，甲酸只在堿性環境下積累（pH7.3）,而pH6.2以下，不產甲酸， HCOOH → CO2+H2。甲酸脫氫酶與氫化酶聯合作用。 傷寒桿菌無甲酸脫氫酶，只產酸不產氣。 2節：分解代謝 一、淀粉的分解 淀粉有兩類：一類是直鏈淀粉（α-1，4-糖苷鍵）；另一類是支鏈淀粉（支鏈α-1，4、分支點α-1，6-糖苷鍵）。 1、液化型淀粉酶（α-淀粉酶）：分子內α-1，4-糖苷鍵，不作用α-1，6-糖苷鍵以及靠近α-1，6-糖苷鍵的α-1，4-糖苷鍵。作用的結果是產生麥芽糖，含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使黏度下降。枯草桿菌通常用作α-淀粉酶的生產菌。 2、糖化型淀粉酶：這是一類酶的總稱。共同特點是可以將淀粉水解成麥芽糖或葡萄糖，包括以下三種： （1）淀粉-1，4-麥芽糖苷酶（β-淀粉酶）：從非還原性末端開始，按雙糖為單位，逐步作用于α-1，4生成麥芽糖。但不作用于α-1，6，遇到α-1，6時，作用停止。作用于淀粉后的產物是麥芽糖與極限糊精。 （2）淀粉-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）： 從非還原性末端開始，依次以葡萄糖為單位逐步作用于α-1，4，生成葡萄糖，但能越過α-1，6。根霉與曲霉普遍都能合成與分泌此酶。 （3）淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）：此酶專門作用α-1，6-糖苷鍵。 二、纖維素與半纖維素的分解 纖維素是葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接，分子量更大，不溶于水，不能直接被人和動物消化，但它可以被許多真菌包括木霉、青霉、根霉以及放線菌與細菌中的一些菌株分解與利用 纖維素酶復合物：纖維二糖酶（β-葡萄糖苷酶），C1酶， Cx酶。 天然纖維素 C1酶 水合非結晶纖維素 Cx酶 纖維二糖+葡萄糖 纖維二糖酶 葡萄糖 細菌的纖維素酶位于細胞膜上，真菌和放線菌的纖維素酶是胞外酶。 自然界中纖維素豐富，對纖維素的研究早就成為重要的課題了。 在植物細胞壁還有半纖維素，包括各種聚戊糖與聚已糖，最常見的半纖維素是木聚糖。半纖維素容易被微生物分解，但由于半纖維素的組成類型很多，因而分解它們的酶也各不同。生產半纖維素酶的微生物主要有曲霉、根霉、木霉等。 三、果膠質的分解 果膠質是構成高等植物細胞間質的主要物質，主要由D-半乳糖醛酸通過α-1，4-糖苷鍵連接。 天然果膠質（原果膠）原果膠酶 水溶性果膠 果膠甲酯水解酶 果膠酸 果膠酸酶 半乳糖醛酸。 分解果膠的微生物主要是一些細菌和真菌，麻類植物漚浸脫膠技術就是為了利用果膠分解菌分解果膠的能力。 四、幾丁質的分解 幾丁質由N-乙酰葡萄糖胺通過β-1，4-糖苷鍵連接起來，含氮多糖。是真菌細胞壁和昆蟲體壁的組成成分，一般生物都不能分解與利用，只有某些細菌和放線菌能分解與利用。 幾丁質酶使幾丁質水解生成幾丁二糖，再通過幾丁二糖酶進一步水解生成N-乙酰葡萄糖胺。 五、油脂的分解 油脂在脂肪酶（Lipase）的作用下，逐步被水解生成甘油與脂肪酸，脂肪酸通過β-氧化進行分解。脂肪酶一般廣泛存在于真菌中。 六、烴類化合物的分解 烴類化合物是一類高度還原性的物質，在好氧條件下，可以被一些微生物分解，主要是假單胞菌、分枝桿菌、諾卡氏菌、某些酵母等。 1、甲烷氧化： 2、正烷烴氧化： 先烴化酶（單氧酶）、鐵硫蛋白和鐵硫蛋白-NADH2還原酶作用。 三種方式：a:末端甲基氧化， b:次末端亞甲基氧化， c:兩端甲基氧化 ? 氧化。 3、芳香烴氧化 含苯環或聯苯類化合物，在氧化過程中逐步被氧化生成兒茶酚或原兒茶酚。兒茶酚或原兒茶酸可以在苯環的鄰位上或間位上被氧化打開，生成脂肪族化合物，再逐步分解成糖分解途徑中的中間體物質，再按糖代謝的方式進行分解。 苯（聯苯）→兒茶酚→開環（鄰位、間位） →繼續降解。 七、蛋白質的分解 蛋白酶（胞外） 肽酶（胞內） 蛋白質 肽 AA 一般真菌分解蛋白質的能力強，并能分解天然的蛋白質，而大多數細菌不能分解天然蛋白質，只能分解變性蛋白以及蛋白質的降解產物。 根據肽酶作用部位不同，分為氨肽酶（作用于有游離氨基端的肽鍵）；羧肽酶（作用于有游離羧基端的肽鍵）。 腐化 decay 和腐敗 putrefaction 八、氨基酸的分解 1、脫氨作用 有機含氮化合物在微生物作用后放出氨的生物學過程中，通常稱為氨化作用。 （1）氧化脫氨：氨基酸在有氧條件下脫氨，產生氨與α-酮酸，由氨基酸氧化酶催化。包括脫氨反應（酶促）與水解反應（非酶促）。 （2）還原脫氨作用：在無氧條件下進行，生成飽和脂肪酸和氨。 天冬氨酸 琥珀酸+NH3 （3）水解脫氨與減飽和脫氨： 氨基酸經水解產生羥酸與氨： 氨基酸+水 羥酸+ NH3 通過減飽和方式進行脫氨，生成不飽和脂肪酸和氨： 天冬氨酸 延胡索酸+ NH3 （4）脫水脫氨：含羥基氨基酸（如絲氨酸）在脫水過程中脫氨。 Ser → 氨基丙烯酸 → 亞氨基丙酸 →丙酮酸 + NH3 H2O （5） Stickland反應 某些專性厭氧細菌如梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下生長時，以一種氨基酸作為氫的供體，進行氧化脫氨，另一種氨基酸作氫的受體，進行還原脫氨，兩者偶聯進行氧化還原脫氨。這其中有ATP生成。這個反應被稱為Stickland反應。 供氫體：Ala、Leu、Val、Ser、Phe、Cys、His、Asp、Glu。 受氫體：Gly、Pro、Hyp、Orn、Arg、Trp。 丙氨酸+2甘氨酸 3乙酸+3NH3 2、脫羧作用 通過氨基酸脫羧酶作用，生成有機胺和二氧化碳。有機氨在胺氧化酶作用下放出氨生成相應的醛，醛再氧化成有機酸，最后按脂肪酸β-氧化的方式分解。 氨基酸脫羧酶具有高度的專一性，基本上是一種氨基酸有一種脫羧酶來催化它的分解。 反應中放出的二氧化碳可以用微量測壓計測定，因此可根據一定基質在一定時間內，被單位細胞作用后、產生二氧化碳的量來測定脫羧酶的酶活。另外，也可以分析樣品中的氨基酸的含量。 二元AA生成的二胺有毒。Lys-尸胺，Orn-腐胺 鑒定反應 吲哚實驗與硫化氫實驗是常用的兩個鑒定實驗 1、吲哚實驗：有些細菌可以分解色氨酸生成吲哚可以與二甲基氨基苯甲醛反應生成紅色的玫瑰吲哚，因此可根據細菌能否分解色氨酸產生吲哚來鑒定菌種。 2、硫化氫實驗：許多細菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）產生硫化氫，如果在蛋白胨培養基中加進重金屬鹽，接種細菌培養后觀察，若產生硫化氫，則出現黑色的硫化鉛或硫化鐵。 3節：合成代謝 一、生物合成三要素 能量 、還原力、 小分子前體物 1、能量由ATP供給，ATP產生有三種方式（底物水平磷酸化，氧化磷酸化，光合磷酸化） 2、還原力產生：還原力主要指NADH2 和NADPH2 EMP 與TCA 產生的NADH2有3個去向： 1）供H體（中間產物還原成發酵產物）； 2）通過呼吸鏈產生ATP； 3）用于細胞物質合成。 但NADH2要先在轉氫酶作用下轉變成NADPH2才能用。 NADP+ NADH2 NADPH2+NAD 在體內還有HMP供給NADPH2與磷酸糖 。 1G 2 NADPH2+CO2+5-P-核酮糖 NADPH2在光細菌中可通過非環式光合磷酸化方式產生。 3、小分子前體物：通常指糖代謝過程中產生的中間代謝物，有12 種。 代謝回補順序 1、合成草酰乙酸（OA）回補順序 PEP+CO2 羧化酶 OA+Pi PY+CO2+ATP 羧化酶 OA+ADP+Pi PEP+CO2+GDP 羧化激酶 OA+GTP PY+CO2+NADH2 蘋果酸酶 蘋果酸+NAD á-KD+CO2+NADH2 脫氫酶 異檸檬酸+NAD 好氧性，利用乙酸微生物，以乙醛酸循環補充草酰乙酸。 2、合成PEP的回補順序 PY+ATP PEP合酶 PEP+ADP+Pi PY+ATP+Pi PY雙激酶 PEP+AMP+Ppi OA+GTP PEP羧激酶 PEP+GDP+CO2 OA+PPi PEP羧轉磷酸酶 PEP+Pi+CO2 綜合總結： 二、糖類合成 （一）單糖合成 1、卡爾文環Calvin cycle（光合菌、某些自養菌） （還原的磷酸戊糖環）分為三個階段： ①CO2固定②固定CO2的還原③CO2受體的再生。 關鍵酶：1，5-二磷酸核酮糖羧化酶、磷酸核酮糖激酶。 總反應式： 6CO2+6H2O+18ATP+12NADPH2 G+18ADP+12NADP+18Pi 另外，產甲烷細菌有厭氧乙酰輔酶A途徑，少數光合細菌中有還原性TCA途徑等新的自養CO2固定途徑。 2、EMP逆過程。 3、糖異生作用。 4、糖互變作用：大量是在核苷二磷酸糖水平上進行。 （二）多糖合成 E.coli肽聚糖合成：需1個多糖引物。 1、單糖組分在細胞質中合成(UDP是第一個載體） 2、逐步加上AA生成UDP-NAM-五肽（Park 核苷酸），順序為L-Lys, D-Glu, DAP, D-Ala, D-Ala ( 不需tRNA參與）。其中，2D-Ala D-丙酰-D-Ala(青霉素類似） 此階段在細胞質中進行。 3、 UDP-NAM-五肽轉至膜上，與一脂質載體（細菌萜醇 -C55類異戊二烯醇）結合，釋放出NAM-五肽焦磷脂，在膜內側與UDP-NAG結合，構成肽聚糖亞單位。 細菌萜醇是第二個載體。 4、亞單位轉移至細胞壁的生長點上（插入），萬古霉素、桿菌肽抑制。 5、在細胞膜外側，亞單位與引物相連（轉糖基作用），再通過轉肽酶作用，將亞單位末端的D-丙-D-丙拆開，第四個AA與另一亞單位的DAP之間交聯，另一D-Ala釋放。 在這一步，由于青霉素是D-丙-D-丙的結構類似物，則轉肽酶被抑制，造成肽鏈間無法交聯，網狀結構也連不起來，形成 軟壁 ，極易破裂死亡。青霉素只對正生長菌起作用，對靜息細胞無作用。 、氮類物質合成 （一）生物固氮 分子N2通過固氮微生物作用形成NH3的過程。 1、固氮微生物 （都是原核微生物） ①自生固氮菌：好氧、厭氧、兼性厭氧及各種營養類型。 ②共生固氮菌：與豆科共生為根瘤菌，與非豆科共生是放線菌。 ③聯合固氮菌：根際、葉面微生物。 2、固氮機制 只有在不含有化合態氮的培養基上生長，且提供ATP、還原力等條件下才能固氮。 總反應式： Mg2+ N2+6e+6H++12ATP 2NH3+12ADP+12Pi 固氮酶 固氮酶 組分Ⅰ：鉬鐵蛋白（MoFd） 組分Ⅱ：鐵蛋白（AzoFd) 都對氧極敏感，遇氧失活，需厭氧條件固氮。 固氮過程： 電子載體：鐵氧還蛋白（Fd），黃素氧還蛋白（Fld）也可以。 每步只傳遞2e，N2 2NH3需6e，連續三次。 固氮酶底物專一性不高，還能催化一些反應。 C2H2→C2H4， N2O→N2+H2O， HCN→CH4+NH3+CH3NH2， 2H+→H2。 其中C2H2→C2H4 ，可用氣相色譜檢測，可作為固氮系統存在的有效指標。 N2 2NH3去路：自生固氮菌不能儲存，也不分泌，很快同化；共生固氮菌分泌至根瘤細胞中為植物所利用。 （二）氨基酸合成 1、直接從培養基中吸收。 2、通過轉氨作用合成其他的氨基酸： Glu + 丙酮酸 α-酮戊二酸 + Ala Glu + 草酰乙酸 α-酮戊二酸 + Asp 這類反應是由氨基移換酶催化而成。 3、微生物經氨化作用或經固氮作用生成的氨可以通過特定的反應來吸收生成新的氨基酸（氨同化作用） α-酮戊二酸+NH3 谷氨酸脫氫酶 Glu +水 NH3+ATP Glu á-KD、PY、OA Gln合成酶 轉移酶 ADP+Pi Gln Glu、Ala、Asp 4、從前體合成氨基酸。 按前體不同可將20種氨基酸為六組： （一）3-磷酸甘油醛：絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸 （二）4-磷酸赤蘚糖和磷酸烯醇式丙酮酸：色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸 （三）丙酮酸：丙氨酸,亮氨酸、纈氨酸 （四）α-酮戊二酸：谷氨酸、谷酰氨 脯氨酸、精氨酸、賴氨酸（真菌中） （五）草酰乙酸：天冬氨酸 天冬酰氨 甲硫氨酸 蘇氨酸 異亮氨酸 賴氨酸（細菌） （六）5-磷酸核酮糖+ATP：組氨酸 初生氨基酸：Ala, Glu, Asp, Gly，氨基化所生成的氨基酸。 次生氨基酸：以初生氨基酸為前體合成。 工業生產氨基酸 最初利用蛋白質水解法生產，1957年開始用發酵法生產。近年采用生化合成法： 1、酶轉化法 反丁烯二酸+NH3 Asp酶 L-Asp 丙酮酸+NH3+苯酚 Tyr酶 Tyr 2、完整細胞酶合成：選用酶活力高菌種，處理菌體使物質易透過。 DL-Ser+丙酮酸+苯酚 菌體 L- Tyr 丙酮酸+ NH3+吲哚 菌體 L-Trp 4節：代謝調控 代謝-生化反應-酶催化-基因編碼→基因調控 ↓ 環境因子影響 環境調控 代謝調節部位：真核和原核 合成調節：誘導合成、終產物阻遏、分解代謝物阻遏 酶 活性調節：反饋（終產物）抑制、酶活性共價修飾 一、主要調節機制 （一）酶的誘導合成 Karstrom 適應酶 Monod 誘導酶 組成酶 Cohn 組成酶 誘導劑不一定是底物，但底物大多數情況下是有效誘導劑。 誘導酶只在有誘導劑時才合成，除去誘導劑就停止。是全新合成，而不是原有酶的激活。 某些酶的誘導物 操縱子學說 Monod & Jacob, 1962 調節基因 操縱子 P R t P O z y a t mRNA RNA多聚酶 無誘導物時，結合。 阻遏物 有誘導物時，脫落。 （二）終產物阻遏（反饋阻遏） 主要在合成代謝途徑中，終產物或其衍生物對該途徑上一個或多個酶形成的抑制作用。 如E. coli Met, Arg的合成。 機制：調節基因 原阻遏物（阻遏物蛋白） 與終產物結合時被激活，與操縱基因結合，阻止結構基因轉錄。終產物為輔阻遏物。屬于正調節。 （三）分解代謝物阻遏（葡萄糖效應） Monod研究E. coli 對混合碳源利用，發現葡萄糖抑制其它糖利用，出現二次生長。 所有迅速代謝能源都能阻抑較慢代謝的能源所需酶的合成。酶的生成被易分解碳源所阻遏。此稱葡萄糖效應。 酶大多數是誘導酶。 葡萄糖效應并不是由葡萄糖直接造成，而是葡萄糖某種分解代謝物引起。 cAMP（環腺苷酸）是關鍵控制因子。 其與分解代謝物活化蛋白（CAP）結合，促使RNA多聚酶與啟動基因結合而開始轉錄。 cAMP濃度低時，影響結合，不能轉錄。 葡萄糖的某種代謝產物降低了cAMP水平，即使有誘導劑存在，也不能合成分解其它糖的酶，只有葡萄糖消耗完， cAMP水平上升，才能開始轉錄、合成。 ATP 腺苷酸環化酶 cAMP 磷酸二酯酶 AMP （四）反饋抑制 1、協同反饋抑制：終產物不能單獨抑制，要幾個終產物同時作用，合作抑制。如多粘芽孢桿菌的Asp族氨基酸合成。6-53 2、合作反饋抑制：兩種終產物同時存在，起著比一種大得多的抑制。 圖6-54 3、同工酶：多個酶催化同一個反應，分別受不同終產物抑制。圖6-51 如大腸桿菌的Asp族氨基酸合成，圖6-52 4、順序反饋抑制：代謝途徑中第一個酶不受終產物抑制，而受分支處中間產物抑制，終產物抑制引起中間產物積累，從而抑制第一個酶。圖6-57 如紅色假單胞菌的Ile合成。 5、積累反饋抑制：每一個終產物單獨、部分地抑制共同步驟的第一個酶，互不影響。圖6-55 如大腸桿菌的Gln合成酶受8個終產物抑制。圖6-56 調節位點（變構中心） 反饋抑制機制：變構酶 底物位點（活性中心） （五）酶活性共價修飾 由一個修飾酶（活化酶）催化另一種酶起共價修飾的改變，從而改變后者活性。 酶-X 酶 + X （X：小分子化合物） 修飾酶 如大腸桿菌Gln合成酶：AMP與酶共價結合時（腺苷酰轉移酶催化）活性低，脫去AMP，活性高。 膠質假單胞菌檸檬酸裂解酶：乙酰化（有活性），脫乙酰化（無活性） 二、代謝調控應用 (一）在初級代謝產物生產上應用 反饋調節最重要，要繞過，方法如下： 1、降低末端產物濃度（應用營養缺陷型解除正常反饋調節） 單線途徑：應用營養缺陷型積累中間代謝物，采用低濃度終產物供給。 Ea Eb Ec A B C D E Ec 缺失，積累C，低濃度供給E。 分支途徑：積累末端產物。 E1 F G A B C D E E2 H I E1缺失，限制I，少量E→G，大部分分泌。 Lys生產：高Ser缺陷型，圖6-62 肌苷酸生產：腺嘌呤缺陷型，圖6-63 2、篩選抗反饋突變株（解除反饋） 在含有抗代謝物的培養基中培養，篩選抗性突變株，其中一些可分泌大量末端產物。如對氨基Phe/Tyr, 7-氮雜Trp/Trp 3、控制細胞膜滲透性 通過生理學或遺傳學方法，改變膜透性，使胞內代謝物迅速滲漏到胞外，解除反饋抑制。 （二）在次級代謝產物生產上應用 次級代謝產物通常在細胞生長后期形成，主要是抗生素、毒素、甾體化合物等。在自然條件下，微生物產生次級產物能力一般不高，其生產也受代謝調控。 可通過誘變育種和控制環境條件來提高產量，但次級產物合成途徑比較復雜，許多還不清楚，因此關于次級產物合成的確實控制部位還大多不明。 青霉素生產中，葡萄糖雖能很好利用，但生產不適宜，而乳糖雖緩慢利用，卻可多產青霉素。在含葡萄糖和乳糖混合培養基中，生長階段迅速利用葡萄糖，葡萄糖用盡時，對乳糖利用解阻遏，不生長，但產青霉素。也可利用后期流加限量葡萄糖的方法實現。 其他次級產物生產也廣泛采用這種方法。另外，氮源種類、濃度對次級產物產生與積累也有很大的影響，磷酸鹽也有影響。 （三）在酶生產上應用 酶合成受基因和代謝物雙重控制 1、加誘導劑 誘導酶只有在誘導劑存在時形成，在培養基中加入誘導劑。要注意底物誘導劑的濃度。 2、降低阻遏物濃度 參與分解代謝的酶，通常受誘導和阻遏雙重控制，包括終產物阻遏和分解代謝物阻遏。為了大量生產酶，要避免使用豐富，復雜培養基，不要含快速利用的糖類。合成酶類通常被終產物阻遏，要對產生阻遏的化合物加以限制。 3、利用突變產生不需誘導物或不受阻遏的突變體 （1）生長在低濃度誘導物中選育不需誘導劑的組成性突變株。 （2）利用抗代謝物，篩選不受終產物阻遏的突變體。 （3）利用被阻遏的酶的底物作唯一的碳源，可篩選不受分解代謝物阻遏的突變體。 4、增加基因模板 將外源特異基因導入微生物體內，增加酶產量。 （1）游離基因轉移法 （2）phage轉導法 5節：自養菌代謝（微生物的自養代謝） 一、光能自養菌 藍細菌與高等植物相同，含葉綠素a, b, 其余含菌綠素，有光合膜。光合作用只在有光合色素存在時才進行。 葉綠素（主要色素）：捕獲能量與光反應中心 光合色素 類胡蘿卜素（輔助色素）：只捕能并傳至葉綠素 （一）主要類群 P150表解 屬于原核微生物，歸于紅螺菌目，利用硫化氫、氫氣或有機物作為供氫體。常存在于水較清，可透光的厭氧環境中。 1、紅螺菌科（紫色無硫細菌）：有機物為供氫體，兼性光合。光能異養。 2、著色菌科（紫色硫細菌）：專性厭氧，專性光合，硫化物為供氫體，體內外積累硫。光能自養。 3、綠菌亞目：綠菌科-綠硫細菌，綠彎菌科-綠色非硫細菌。專性厭氧，專性光合，硫化物為供氫體，胞外積累硫。 （二）光合作用 光反應：光合色素吸收光能并轉化為化 學能的能量轉換反應。 暗反應：利用能量進行CO2同化。 光合磷酸化即光能引起葉綠素分子逐出電子，并通過電子傳遞產生ATP的方式。 1、環式光合磷酸化 逐出電子經電子傳遞又回到菌綠素，使其恢復到原狀態，其間產生ATP，但不產生還原力，不放出氧氣。光合細菌屬此類。P151，圖6-33 光合菌還原力來自硫化氫，方式可能是逆向電子傳遞，消耗光反應產生的ATP。 H2S + NAD S + NADH2 積累硫 NADH2+NADP NAD+NADPH2 2、非環式光合磷酸化 兩個光反應系統，除產生ATP，還有還原力，放出氧氣。植物、藍細菌屬此類。 還原力來自水的光解。P151,圖6-34 3、噬鹽菌紫膜的光合作用 無葉綠素或菌綠素參與的獨特的光合作用，是迄今為止最簡單的光合磷酸化反應。（自學） 二、化能自養菌 無機物氧化獲能,通過卡爾文環同化CO2 產能主要方式是氧化磷酸化，還原力產生是逆向電子傳遞。P148,圖6-30 無機物氧化時，以不同位置進入呼吸鏈，這與異養菌不同，產能效率低。圖6-31 1、硝化細菌 將氨氧化成亞硝酸-亞硝酸細菌 亞硝酸氧化成硝酸-硝酸細菌 NH4++1?O2→NO2-+2H++H2O+66千卡 NO2-+?O2 →NO3-+18千卡 圖6-32 2、硫細菌 引起元素硫或還原態硫化物氧化，包括光能與化能。化能即硫化細菌。最多是硫桿菌Thiobacillus。 S2-→S→SO32-→SO42- 由于產硫酸，會引起金屬腐蝕，也可用于濕法冶金。 2S+3O2+2H2O →2H2SO4（T. thiooxidans) 4FeSO4+O2+2H2SO4 →2Fe2(SO4)3+2H2O(T. ferrooxidans) 硫酸及硫酸高鐵是有效浸溶劑。 CU2S+ 2Fe2(SO4)3 →2CUSO4 + 4FeSO4 +S FeS2 +7Fe2(SO4)3 +8H2O →15FeSO4 + 8H2SO4 3、氫細菌 兼性自養菌。H2 +?O2 →H2O+56.5千卡弧菌。 耐氣厭氧菌（aerotolerant)-無論有氧無氧，都進行發酵，分子氧無害。如乳酸菌。 |